1.低溫透射電鏡技術(shù)概述
低溫透射電鏡技術(shù)是在低溫下(通常在 90K)將液相樣品中的水或其它溶劑快速冷凍固定后，在低溫環(huán)境下使用透射電鏡進(jìn)行觀察的技術(shù)。低溫透射電鏡實(shí)驗(yàn)要求樣品在制樣、傳輸和觀察整個(gè)過程中都保持在低溫狀態(tài)(通常低于100 K)，相對(duì)于常溫透射電鏡，其優(yōu)勢(shì)有：1)快速冷凍制樣技術(shù)將樣品固定在玻璃態(tài)的冰層中，避免了水或溶劑結(jié)晶對(duì)樣品結(jié)構(gòu)的破壞，能夠保持液相中有機(jī)分子自組裝體和化學(xué)反應(yīng)中間體的微觀結(jié)構(gòu)，避免了樣品干燥引起的結(jié)構(gòu)變化;2)高分子及化學(xué)反應(yīng)體系常常具有非平衡態(tài)結(jié)構(gòu)，快速冷凍制樣技術(shù)能夠保持住非平衡態(tài)結(jié)構(gòu)，進(jìn)而得以觀察;3)低溫條件能夠盡可能保持有機(jī)和高分子等軟物質(zhì)材料的微觀結(jié)構(gòu)，顯著減少電子束對(duì)樣品的損傷。
2.系統(tǒng)組成及操作流程
分析測(cè)試中心電鏡組利用現(xiàn)有儀器(Leica EM GP 全自動(dòng)載網(wǎng)投入冷凍儀、Gatan 626 單傾冷凍傳輸樣品桿、Jem-2011 透射電鏡等)，開展了低溫透射電鏡工作。具體操作流程如下：
2.1 冷凍制樣
冷凍制樣的關(guān)鍵是要在載網(wǎng)上得到厚度合適的玻璃態(tài)的冰層。冷凍環(huán)境下， 樣品中溶劑(水)的粘性會(huì)顯著提高，在極高的粘性下，所有樣品組分包括水都被完全固定，不能移動(dòng)。但是，當(dāng)水分子結(jié)晶形成冰晶，就會(huì)破壞樣品的結(jié)構(gòu)， 因此，要阻止冰晶形成，使得水成為玻璃態(tài)(vitrified), 或者稱之為非結(jié)晶態(tài)冰(無定形冰)。
水結(jié)晶的條件包括：(1)溫度必須低于熔點(diǎn)(常壓下水容易形成過冷水， 從 231 K 開始結(jié)晶);(2)具有晶核;(3)有足夠的能量，高于重結(jié)晶溫度(常壓下，純水的重結(jié)晶溫度約為 136K, 低于這一溫度，水分子沒有足夠的能量進(jìn)行分子重排，從而無法結(jié)晶);(4)有足夠的時(shí)間分子重排。純水在 231 K～136K 的溫度范圍內(nèi)經(jīng)過一定的時(shí)間可以結(jié)晶形成冰晶，所以要得到玻璃態(tài)的冰，就需要降溫時(shí)迅速通過這一溫度范圍，即要求快的冷凍速率和盡可能窄的結(jié)晶溫度范圍。
凍冷速率隨樣品厚度的變化圖
對(duì)于一定的樣品而言，水的熱擴(kuò)散率和樣品厚度決定了樣品的冷凍速率[1,2]。在常壓情況下，只有當(dāng)冷凍速率大于 5 105 K/s，才有足夠的時(shí)間提取熱量防止冰晶產(chǎn)生。同時(shí)，水的熱擴(kuò)散率很差，對(duì)于較長距離，熱量無法有效釋放(圖 1)。例如，對(duì)于 600µm 厚的含水樣品，即使其表面冷凍速率達(dá)到理論臨界冷凍速率(> 5 105 K/s)，在距離樣品表面 150µm 處，冷凍速率也會(huì)降到低于 1000 K/s。因此，在常壓下，很難形成較厚的玻璃態(tài)的冰層。20 世紀(jì) 70 年代，Moor 引入了高壓冷凍固定法[3,4,5,6]。增加壓力到一定程度可顯著降低水分子的成核溫度， 縮短水的結(jié)晶溫度區(qū)間(圖 2)，從而增加了冷凍固定樣品的厚度。
水的相圖
在常壓下，100nm 厚水膜可以被有效玻璃化冷凍[8]，滿足此條件的樣品可以選擇投入式快速冷凍制樣法。高壓條件下，可以有效固定 200 mm 以下的厚水膜，適合此條件的樣品可以選擇高壓冷凍技術(shù)制樣法。
2.1.1 投入式快速冷凍制樣
投入式快速冷凍制樣是液相樣品進(jìn)行冷凍固定的基本方法，是將樣品快速插入到液態(tài)乙烷中(90K，以液氮冷凍)，使樣品中的水/其他溶劑快速冷凍(冷凍速度可達(dá) 10,000K/s)固定于電鏡載網(wǎng)上，此過程中水和其它溶劑不結(jié)晶成為玻璃態(tài)(vitrified)，能夠最大限度的保持樣品的結(jié)構(gòu)。這種制樣方法要求樣品大小、厚度、粘度等不能太大，否則可能會(huì)出現(xiàn)樣品脫落，電子束無法穿透樣品，不能通過自動(dòng)吸附過程得到厚度合適的樣品薄膜等情況。
在投入式快速冷凍技術(shù)中，采用將載網(wǎng)以自由落體的形式快速投入到冷凍劑中的方式，是因?yàn)槌晒Φ睦鋬龉潭ㄈQ于冷凍過程是否能夠迅速通過水結(jié)晶的溫度范圍，要求冷凍速度太快以至于水來不及結(jié)晶。冷凍劑選擇的是在液氮“水浴” 環(huán)境中的液化乙烷。乙烷的比熱比氮?dú)獾谋葻岣?，冷凍速度更?乙烷的沸點(diǎn)比氮?dú)飧?，在液?ldquo;水浴”環(huán)境中可以液化，得到一個(gè)更加穩(wěn)定且快速的冷凍環(huán)境。
具體操作步驟為：將載網(wǎng)(一般選用 GiG-C321 型號(hào)的微篩陣列碳支持膜) 置于一個(gè)溫度/濕度可控的環(huán)境倉中，溫度可在 279K- 335K 之間調(diào)節(jié)，濕度可在大氣濕度到 99%調(diào)節(jié)(圖 3a, 3b)。在電鏡載網(wǎng)上滴加樣品懸液后(通常3μL，圖 3a)，通過濾紙自動(dòng)吸附過程吸走一些樣品留下適量樣品形成電子束能夠穿透的薄膜，然后載網(wǎng)被快速投入液態(tài)乙烷中進(jìn)行冷凍(圖 3c)。在投入冷凍完成后，將載網(wǎng)快速轉(zhuǎn)移到樣品盒并保存在液氮中，用于后續(xù)觀察。
a)在可控的樣品環(huán)境倉內(nèi)向載網(wǎng)上滴加樣品 b) 可編程的參數(shù)設(shè)定 c)液化乙烷的頭部液化裝置
2.1.2 高壓冷凍制樣
在常壓下，技術(shù)改進(jìn)并不能幫助玻璃化冷凍更厚的樣品。而高壓條件下，降低了水的結(jié)晶溫度范圍和臨界降溫速率，使得到的有效玻璃化厚度更大。因此要制備尺寸較大、粘度較高的樣品，需要通過加壓來實(shí)現(xiàn)。
Leica EM HPM100 型高壓冷凍儀冷凍曲
從 Leica EM HPM100 型高壓冷凍儀冷凍曲線圖[11]中，我們可以看出，在 10ms 內(nèi)，壓力升高至 200MPa，一旦達(dá)到所需壓力值，溫度開始下降(從 310K 開始)，當(dāng)溫度降至晶核形成溫度(181K)直到溫度低于約 136K，這一溫度區(qū)間內(nèi)，冰晶可以形成。對(duì)于 200 mm 厚的樣品，樣品中心區(qū)域通過這一溫度區(qū)間大約需要 30ms，壓力平均值 204.5MPa。
高壓冷凍方法是目前唯一能夠?qū)⒉ＡЩ暮襁_(dá) 200 mm 的冷凍固定方法。由于高壓冷凍的樣品較厚，無法直接進(jìn)行透射電鏡觀察，因此在冷凍固定后，需要使用冷凍超薄切片機(jī)在冷凍狀態(tài)下超薄切片，制得適合透射電鏡觀察的樣品方可進(jìn)行冷凍透射電鏡觀察。高壓冷凍固定技術(shù)由于樣品冷凍固定的時(shí)間必須要足夠快(小于 50 毫秒)，所以局限是對(duì)樣品的大小有限制(直徑：1-2mm，最大厚度：200 mm).
2.2 冷凍傳輸
將制得的冷凍透射樣品，在液氮中轉(zhuǎn)移至低溫樣品裝載裝置，置于冷凍樣品桿上，樣品固定好之后，快速的將樣品桿拔出轉(zhuǎn)移到透射電鏡中。在樣品轉(zhuǎn)移和觀察中保持在低溫環(huán)境(通常低于 100K)。
冷凍傳輸系統(tǒng)保證了樣品從裝入樣品桿到進(jìn)入電鏡的整個(gè)過程中都處于一個(gè)低溫并且相對(duì)潔凈的環(huán)境中，避免樣品在轉(zhuǎn)移過程中因?yàn)闇囟鹊母淖儽黄茐幕蛘咭驗(yàn)楸┞对诖髿庵斜晃廴尽?/p>
2.3 低溫透射電鏡樣品的測(cè)試
目前，分析測(cè)試中心電鏡組是利用冷凍傳輸樣品桿在透射電鏡 Jem-2011 上實(shí)現(xiàn)低溫透射電鏡樣品的測(cè)試，可以滿足一部分樣品的測(cè)試需求，但是由于這臺(tái)電鏡為普通透射電鏡，所以樣品的漂移穩(wěn)定性較差，而且無法使用低劑量技術(shù)致使很多樣品的冰層容易破壞，所配置相機(jī)成像的襯度也有限，很多低襯度樣品無法進(jìn)行觀察。為了獲得高分辨率、高襯度的結(jié)果，分析測(cè)試中心今年將引進(jìn)一臺(tái)專門的低溫透射電鏡(Cryo-TEM)，與普通透射電鏡相比，專業(yè)的低溫透射電鏡的極靴是冷凍型極靴，即在極靴部分增加了一個(gè)冷凍盒(圖 5)。冷凍盒可以保持樣品周圍的低溫環(huán)境，既減少了樣品上冰(晶) 沉積引起的污染，也大大減少了樣品的漂移，同時(shí)配備高性能相機(jī)，顯著提高成像的襯度和速度。
具體地，低溫透射電鏡的特點(diǎn)包括：(1)分辨率更高，可以得到更好的高分辨成像;(2)可以使用較低的電子束，精確控制電子劑量使冰層不被打壞;(3)漂移穩(wěn)定性好，可以長時(shí)間的有效采集數(shù)據(jù)并進(jìn)行三維重建;(4)可選擇過濾特定的能量，去除雜散/背底信號(hào)，提高襯度，提高信噪比;(5)可通過增加相位板、高性能相機(jī)等配件進(jìn)一步提高樣品襯度及空間分辨率。
低溫透射電鏡的冷凍極靴示意圖
3.低溫透射電鏡應(yīng)用實(shí)例
膠束體系對(duì)于濃度、pH、添加劑種類等液相環(huán)境條件的變化非常敏感，如果是干燥狀態(tài)其結(jié)構(gòu)與有液相完全不同，因此必須用低溫透射電鏡表征其結(jié)構(gòu)。通常情況下，膠束有球狀、囊泡狀、棒狀、層狀、六角束狀、洋蔥狀、蠕蟲狀等多種形狀，圖 6 是分析測(cè)試中心電鏡組用現(xiàn)有的低溫透射電鏡系統(tǒng)觀察得到的囊泡及球狀、棒狀、短線狀膠束的透射電鏡圖，可以看出應(yīng)用冷凍透射電鏡技術(shù)， 囊泡、膠束的結(jié)構(gòu)被原位的真實(shí)呈現(xiàn)出來，可清晰地觀察到囊泡的完整性、分布、大小、融合等情況，而在普通電鏡條件下，干燥后的囊泡的形狀、結(jié)構(gòu)很容易發(fā)生變化。
應(yīng)用分析測(cè)試中現(xiàn)有的低溫透射電鏡系統(tǒng)得到的透射電鏡圖 a)囊泡 b)融合囊泡c)球狀、棒狀膠束 d)線狀膠束
應(yīng)用分析測(cè)試中現(xiàn)有的低溫透射電鏡系統(tǒng)得到的的透射電鏡圖 a)帶狀聚合物 b)線狀聚合物
同樣，低溫透射電鏡也能夠有效保持聚合物在液相的形態(tài)，如上圖是應(yīng)用我們現(xiàn)有的低溫透射電鏡系統(tǒng)得到的帶狀、線狀聚合物的電鏡圖，可清晰地觀察到聚合物的形態(tài)及聚集狀態(tài)。
目前，低溫透射電鏡在生物大分子的成像尤其是蛋白結(jié)構(gòu)的解析方面已經(jīng)取得了諸多突破的成果，相信在化學(xué)分子材料領(lǐng)域也會(huì)展現(xiàn)很好的應(yīng)用前景。
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