北京市營養(yǎng)源研究所科威華公司王珂 溫凱李東 100054

食物過敏原可以定義為包含在食物中引發(fā)或激起過敏反應(yīng)的物質(zhì)，在Ⅰ型IgE應(yīng)激的過敏反應(yīng)中，過敏原通常是在特定食品中含有的含量豐富、天然存在的蛋白質(zhì)。 隨著全球經(jīng)濟(jì)一體化和食品貿(mào)易國際化，食品過敏問題具有更大的潛在危險性，因此建立可靠、定量的過敏原檢測方法對于確保食品標(biāo)簽的一致性和消費者的安全十分必要。然而因為食物過敏原在食品中的含量少以及可能被食品基質(zhì)包裹等原因，食物過敏原的生物活性的檢測十分困難，另一個檢測問題是檢測方法的靈敏度，一般來說，不同食物中檢測極限要求在1—100ppm（每kg食物中含mg量級過敏性蛋白）。 幾乎所有的過敏原（抗原）都是蛋白質(zhì)或多肽類物質(zhì)，多肽分子量一般在5-70KDa之間，也有一些過敏原分子量超過200KDa以上。某種食物或食物制品是否存在致敏性，通常是依據(jù)確診敏感個體血清中鍵合的IgE來判斷，一旦過敏原可以確認(rèn)和純化，就可以在兔子、老鼠、山羊、綿羊或雞這些動物中獲取抗體，為常規(guī)食品分析提供免疫檢測方法。 現(xiàn)在，檢測食物成品中潛在過敏原有幾種技術(shù)上的可能性，采用的方法包括直接檢測過敏原（蛋白質(zhì)）自身或檢測引起食物過敏可能的標(biāo)志物，如果理想的標(biāo)志物就是過敏原蛋白，其化學(xué)特性不能很好表達(dá)或檢測極限達(dá)不到要求，則檢測過敏原不可行。另外，許多致敏食物中包括多種過敏原蛋白，含量也有所不同。作為潛在過敏食物制品或成分的標(biāo)記物，特定的蛋白質(zhì)或DNA片段可以作為靶記進(jìn)行檢測。以檢測蛋白為基礎(chǔ)的方法通常包括免疫化學(xué)檢測方法，例如RAST(radio-allergosorbent test)、EAST（enzyme allergosorbent test）、RIE（rocket immuno-electrophoresis）、免疫印跡（immunoblotting）和ELISA（enzyme-linked immunosorbent assay）。其中RIE和免疫印跡方法是定性和半定量方法，RAST、EAST和ELISA是定量分析方法?，F(xiàn)在只有ELISA法因其準(zhǔn)確性高、易操作和標(biāo)準(zhǔn)化的可能性等，在常規(guī)食品分析中常用。DNA水平上的測試方法是依照多聚酶聯(lián)反應(yīng)（PCR）來識別特定的DNA片段，實時（real-time）PCR方法可以得到高精確度的檢測結(jié)果。 檢測方法的選擇主要考慮所測試的食品特性（有無可檢測的特定抗體或DNA以及可達(dá)到的檢測極限）以及食品制造過程的加工歷史等。以蛋白或DNA為基礎(chǔ)的檢測方法，不同的食物成品的檢出和定量檢測上有各自的優(yōu)、缺點。對于以DNA為檢測對象的過敏原檢測有不同爭議，因為蛋白質(zhì)是過敏原成分而加工過程會對蛋白、核酸等產(chǎn)生不同影響。 下面就幾種常用的檢測和定量方法進(jìn)行討論：RAST/EAST (radio-allergosorbent test/enzyme allergosorbent test） RAST/EAST主要應(yīng)用于食物過敏的臨床診斷，同時也應(yīng)用于食物過敏原的定性檢出以及多品種食物中潛在致敏性的評價。也有少量使用RAST法進(jìn)行過敏原的定量檢測的文獻(xiàn)報道，檢測限為1mgkg-1。RAST或EAST的檢測原理是抗原或過敏原在固定相上與特定的人類抗體IgE鍵合，樣品中的抗原與固定相上的抗原競爭鍵合IgE，一種抗IgE的抗體用同位素（）或酶（，如過氧化物酶）標(biāo)記，加入可以改變顏色或能發(fā)光的底物用來檢測鍵合IgE的抗體量，鍵合的IgE用γ-計數(shù)器或分光光度計來定量檢測。此兩種方法的最大缺點是無法獲取過敏人群的血清以及評價方法的標(biāo)準(zhǔn)化困難。RIE （rocket immuno-electrophoresis） RIE使用含有凝膠的抗體，被分析的抗原按照自身的電泳能力在凝膠中移動直到抗體和抗原結(jié)合，所形成的電泳峰高與檢測抗原量成比例。RIE法檢測不同食品中的幾種抗原的檢測極限約為2.5-30 mgkg-1。該方法的局限是實驗所需的凝膠制備和免疫環(huán)節(jié)的操作程序比較復(fù)雜。免疫印跡（IB） （immunoblotting） 點式免疫印跡測試法主要用于簡單或廉價食品樣品的檢測，提取的樣品蛋白噴灑在硝化纖維膜或PVPF膜上，用特定的與目標(biāo)抗原結(jié)合的抗體進(jìn)行酶標(biāo)記，酶與底物反應(yīng)呈現(xiàn)出有顏色的斑點，斑點的深淺與抗原的含量成比例。這種方法是半定量測量方法，但對某些食物（如花生）中的蛋白檢出限可達(dá)到2.5 mgkg-1。ELISA （enzyme-linked immunosorbent assay） 現(xiàn)在ELISA是食品工業(yè)和政府食品管理部門進(jìn)行食品中潛在過敏原檢測和定性最常用的方法，用這種方法特定的蛋白或抗原可以與特定的酶標(biāo)記的抗體鍵合后用顯色反應(yīng)來定性和定量，靠標(biāo)準(zhǔn)曲線來計算抗原的含量。 ELISA的檢測方式有兩種：競爭式（competitive）ELISA法和夾心式（sandwich）ELISA法，后者是最常用的食物過敏原的免疫評價方法。 夾心式ELISA方法是用固定在固定相上的捕獲抗體，樣品中特定的蛋白被第一個抗體捕獲，然后被第二個特定的以酶標(biāo)記的抗體檢出，而第二個抗體與被分析物鍵合，從而形成夾心式。與第二個抗體相連的酶與特定的底物反應(yīng)形成有顏色的產(chǎn)物，它的吸收峰與被分析物的濃度線性相關(guān)。此種方法用于多種食物過敏原的檢測，有多種檢測工具包上市。 競爭式ELISA方法是測定相對較小蛋白質(zhì)優(yōu)先選擇的方法。它包含一個鍵合在固定相上的固定抗原，血清和一定比例稀釋樣品提取物（作為抑制劑）培養(yǎng)后添加到固相抗原上。如果樣品中沒有抗原出現(xiàn)，酶標(biāo)記的抗體表現(xiàn)出與固定相上鍵合的抗原的最大鍵合能力，形成的有顏色的產(chǎn)物的最大吸收。因為樣品中的抗體抑制酶標(biāo)記的抗體與固定的抗原的鍵合，吸收峰與樣品中抗原的濃度成反比。有報道，使用競爭式ELISA方法對某些食物過敏原的檢測極限可以低至0.4μg kg-1。纖維素試紙測試 纖維素試紙測評是近年來發(fā)展起來可以代替ELISA方法的一種測試方法，它具有價格低、快速、方便攜帶、無須儀器設(shè)備、操作簡便等特點。目前，試紙測試只是定性方法，有改進(jìn)的用于測定雞蛋中過敏原的試紙測定方法，具有高度的專一性和靈敏度，檢測限低至0.02 mgkg-1。PCR多聚酶聯(lián)反應(yīng) 以DNA為測試對象的檢測方法越來越多地應(yīng)用到外來食物的檢測中，如轉(zhuǎn)基因谷物等。PCR方法對食物中特定過敏原的檢測具有專一性和靈敏度，但是，PCR方法不能檢測抗原或特定蛋白，因此檢測結(jié)果不能與食物的真正過敏性相關(guān)聯(lián)，而且食品加工過程對蛋白和DNA的影響不同，在一些加工工序中蛋白和DNA可能被分離，因此產(chǎn)品中是否有過敏原，以PCR方法的檢測結(jié)果作判斷可能產(chǎn)生錯誤結(jié)論。PCR方法的優(yōu)點在于，以DNA為測試對象的方法與以蛋白質(zhì)為測試對象的方法相比，熱變性條件下目標(biāo)DNA可以有效提取而不象蛋白提取時受食物基質(zhì)的影響較大；它的另一個優(yōu)點是它的穩(wěn)定性，它不象蛋白質(zhì)組成那樣受地理條件和季節(jié)變化的影響。 特定的DNA片段，側(cè)鏈連接兩個被熱穩(wěn)定的多聚酶化學(xué)修飾的低聚核苷酸作為測定反應(yīng)的初始物，測定反應(yīng)每一個修飾循環(huán)包括三個作用步驟。 普通PCR方法測試結(jié)果只是定性方法，然而選擇合適的內(nèi)標(biāo)物，可以進(jìn)行半定量分析測定，更好的定量方法可以使用即時（real-time）PCR方法或PCR-ELISA聯(lián)用方法。 即時PCR方法與其他DNA定量方法相比，即時PCR方法需要昂貴的實驗室設(shè)備，但準(zhǔn)確度高，勞動強度低。即時PCR方法不用凝膠制品而使用特定目標(biāo)的低聚核苷酸探子，因而實現(xiàn)即時分析。 PCR-ELISA聯(lián)用方法是用特定的以DNA為基礎(chǔ)的方法與相當(dāng)方便和經(jīng)濟(jì)的ELISA測定方法結(jié)合用于半定量分析的分析方法。使用PCR-ELISA聯(lián)用方法，致敏食物中特定的DNA片段被化學(xué)修飾，修飾物與特定的DNA探子標(biāo)記的特定蛋白相結(jié)合，標(biāo)記蛋白與特定的酶標(biāo)記的抗體偶合，以酶-底物反應(yīng)形成的顏色反應(yīng)來定量測定DNA的濃度。生物探測器 使用生物探測器是另一項還未普及應(yīng)用到食品分析中的技術(shù)。生物探測器儀器可以即時測定特定分子之間的反應(yīng)。把一個目標(biāo)分子（可能是抗體（蛋白）或DNA片段）固定到傳感器的表面，然后定量測定一個或兩個分子間的鍵合反應(yīng)。這種技術(shù)的特點是分析時間短、自動化程度高。生物探測器技術(shù)可以用來測定特定的蛋白質(zhì)或過敏原，也可以用于測定特定的DNA片段。該技術(shù)已用于榛子、雞蛋和牛奶中過敏原的檢測。