苦參總生物堿中含有苦參堿、氧化苦參堿、槐果堿等生物堿類成分,苦參堿的含量測定有報道用氣相色譜法、高效液相色譜法(HPLC),但樣品處理方法較復雜。2006年采用HPLC法測定制劑中苦參堿的含量,該方法操作簡便、快速、準確、重現(xiàn)性好,可用于婦得康洗劑的質量控制。
1、儀器和試藥
高效液相色譜LC-6A(日本島津);TCQ-250超聲波清洗儀(北京醫(yī)療設備二廠);電子天平AEG-220(日本島津);紫外分光光度儀UV-265(日本島津);甲醇為優(yōu)級純;乙腈為色譜純;其他試劑均為分析純;苦參堿對照品由中國藥品生物制品檢定所提供(批號:110805-200306)。婦得康洗劑由貴陽舒美達制藥廠有限公司提供(批號:20041001、20041002、20041003、20041004、20041101、20041102、20041103、20041201、20041202、20041203)。
2、方法與結果
2.1 色譜條件
DiamonsilC18(4.6mm×250mm,5μm);流動相乙腈-甲醇-磷酸鹽溶液(25∶10∶65);檢測波長220nm;流速1ml/min;柱溫25℃。
2.2 供試品溶液的制備
取本品50ml,搖勻,精密量取5ml,加濃氨試液調pH=10后,用氯仿(30、30、30、20、20ml)提取5次,合并提取液,揮干氯仿,加甲醇適量溶解殘渣,濾過,濾渣、容器用甲醇洗滌3次,每次5ml,合并洗液與濾液,定量轉移至100ml量瓶中,用流動相稀釋至刻度,搖勻,用0.45μm微孔濾膜濾過,取續(xù)濾液,即得。
2.3 對照品溶液的制備
取經(jīng)P2O5減壓干燥至恒重的苦參堿對照品適量,精密稱定,加流動相制成每毫升約含0.530mg的對照品溶液。
2.4 陰性對照品溶液的制備
取缺苦參總生物堿的樣品適量,依供試品溶液的制備法,制備陰性對照品溶液。
2.5 系統(tǒng)適用性試驗
分別取對照品溶液、陰性對照品溶液、供試品溶液各10μl注入高效液相色譜儀,記錄色譜圖。結果表明供試品色譜中,在與對照品色譜相應的位置上,有相同保留時間的色譜峰,陰性對照無干擾。理論塔板數(shù)為8128。
2.6 線性關系考察
精密稱取苦參堿對照品適量,依對照品溶液制備法制備濃度0.106、0.318、0.530、0.742、0.954g/L的溶液,分別精密吸取上述溶液5μl,按上述色譜條件測定峰面積,以峰面積積分值為縱坐標,對照品質量為橫坐標繪制標準曲線,得回歸方程為:Y=38788X-53(r=0.9998),表明苦參堿在0.53~4.77μg呈線性關系。
2.7 精密度試驗
精密吸取上述苦參堿對照品溶液,重復進樣5次,測定苦參堿峰面積,RSD為1.58%,表明精密度良好。
2.8 穩(wěn)定性試驗
精密量取本品適量,依供試品溶液制備法制備供試品溶液,再精密吸取供試品溶液10μl,依上述色譜條件在0、2、4、6、8h分別進行測定,記錄峰面積,RSD為1.49%,表明供試品溶液在8h內基本穩(wěn)定。
2.9 重復性試驗
分別精密量取同一樣品5份,依供試品溶液制備法制備5份供試品溶液,精密吸取供試品溶液各10μl,依上述色譜條件測定,RSD為0.95%,表明該方法的重復性良好。
2.10 加樣回收率試驗
精密量取0.5ml已知含量(35.767g/L)的婦得康洗劑5份,分別添加苦參堿對照品適量,按上述供試品溶液制備法制備加樣回收供試品溶液,并進行測定,計算回收率,見表1。結果苦參堿的平均回收率為98.6%,RSD為1.17%。
2.11 樣品測定
精密量取樣品適量,依供試品溶液制備法制備供試品溶液,分別精密吸取對照品溶液5μl與供試品溶液10μl注入高效液相色譜儀,依上述色譜條件測定,記錄苦參堿峰面積,重復測定2次,取平均值。結果見表2。表1苦參堿的加樣回收率試驗結果210批樣品中苦參堿的含量
3、討論
3.1 檢測波長的選擇
精密稱取干燥至恒重的苦參堿對照品適量,用流動相溶解配成標準溶液,對苦參堿標準溶液進行全波長掃描,結果表明標準溶液在200nm處有最大吸收,考慮紫外吸收末端干擾大,且樣品中苦參堿含量高,故選擇檢測波長為220nm。
3.2 流動相的選擇
選擇了3種流動相:(1)乙腈-0.02mol/L磷酸二氫鉀溶液(1∶9),氫氧化鈉溶液調節(jié)pH至6.0;(2)乙腈-0.005mol/L庚烷基磺酸鈉溶液(25∶75);(3)乙腈-甲醇-磷酸鹽溶液(25∶10∶65)。經(jīng)多次測試結果表明,流動相(1)峰分離不好,流動相(2)的峰型不好,出現(xiàn)脫尾現(xiàn)象,流動相(3)出峰時間合理,峰型好,分離度大于1.5。
3.3 萃取次數(shù)的考察
取婦得康洗劑5ml,加濃氨試液調pH=10后,分別用氯仿(30、30、30、20、20、20ml)提取3、4、5、6次,合并提取液,揮干氯仿,加甲醇適量溶解殘渣,濾過,濾渣,容器用甲醇洗滌3次,每次5ml,合并洗液與濾液,定量轉移至100ml量瓶中,用流動相稀釋至刻度,通過比較峰面積,5次萃取基本可將苦參堿萃取完全。
3.4 根據(jù)對10批樣品的測定值,暫定本品含苦參總生物堿以苦參堿(C15H24N2O)計,每瓶不得少于0.24g。
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