應(yīng)用優(yōu)勢(shì)

同時(shí)分離九種脂溶性維生素及胡蘿卜素，可避免使用多種HPLC方法，并且可減少在對(duì)膳食補(bǔ)充劑和營(yíng)養(yǎng)強(qiáng)化食品中的脂溶性維生素進(jìn)行定性與定量分析時(shí)所需要進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)步驟?？焖俜蛛x疏水性維生素及胡蘿卜素可顯著提升樣品通量以及減少實(shí)驗(yàn)花費(fèi)，因而可滿足日益增加的法規(guī)依從性需求，以監(jiān)測(cè)大量的分析工作。

沃特世提供的解決方案

配備光電二極管陣列(PDA)檢測(cè)器的ACQUITY

UPC2™系統(tǒng)

Empower® 3軟件

ACQUITY

UPLC® HSS

C18色譜柱

關(guān)鍵詞

維生素、胡蘿卜素、脂溶性、維生素A乙酸鹽、維生素A棕櫚酸鹽、維生素D2、α-生育酚、維生素E乙酸鹽、維生素K1、維生素K2、番茄紅素、β-胡蘿卜素、合相色譜分離術(shù)、UPC2

引言

脂溶性維生素(FSV)包括維生素A、D、E、K及類胡蘿卜素(例如β-胡蘿卜素)。脂溶性維生素參與許多與重要生理功能相關(guān)的復(fù)雜代謝反應(yīng)，例如視力(維生素A)、鈣吸收(維生素D)、細(xì)胞膜的抗氧化(維生素E)、及血液凝固(維生素K)。1β-胡蘿卜素是維生素A的前體，且在人體內(nèi)具有100%維生素A活性。番茄紅素不是人體的必需營(yíng)養(yǎng)素，但它的抗氧化性能使它廣受歡迎，越來(lái)越多地與其他成分一起被添加到某些膳食補(bǔ)充劑中。幾種脂溶性維生素的化學(xué)結(jié)構(gòu)如圖1所示。

維生素及營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充劑是一個(gè)價(jià)值幾十億的市場(chǎng)。預(yù)計(jì)在未來(lái)的五到十年，這一市場(chǎng)仍將繼續(xù)增長(zhǎng)。2這是由于全世界的消費(fèi)者越來(lái)越追求更好以及更健康的生活方式，以及越來(lái)越注重健康以及飲食習(xí)慣。然而，人們也越來(lái)越關(guān)注從營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充劑以及營(yíng)養(yǎng)強(qiáng)化食品中所攝取的脂溶性維生素的安全性問(wèn)題，特別是維生素A及D，若過(guò)量食用，也會(huì)帶來(lái)嚴(yán)重的健康風(fēng)險(xiǎn)。3由于在許多國(guó)家，許多針對(duì)營(yíng)養(yǎng)強(qiáng)化食品及膳食補(bǔ)充劑中所添加微量元素的合規(guī)性的法律正在擬定或制定中，因此，市場(chǎng)上必然對(duì)能夠快速、準(zhǔn)確地分析不同產(chǎn)品中的脂溶性維生素含量的分析方法有更高的需求。

目前，在進(jìn)行FSV分離時(shí)，最常使用的是液相色譜(LC)方法，反向(RP)與正向(NP)方法均有。1，3-5雖然有AOAC法可用于對(duì)食品及營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充劑當(dāng)中的各種脂溶性維生素分別進(jìn)行定性與定量分析，但卻缺少一種可對(duì)維生素預(yù)混物中的脂溶性維生素以及類胡蘿卜素同時(shí)進(jìn)行分析的方法。

3由于超高效合相色譜(UPC2™))分離速度快、經(jīng)濟(jì)耐用，因此可考慮將其用于對(duì)含有多種脂溶性維生素的藥物制劑進(jìn)行快速分析。6在本應(yīng)用紀(jì)要中，我們闡述了一種單次進(jìn)樣方法，它可在四分鐘時(shí)間內(nèi)同時(shí)分離九種脂溶性維生素。優(yōu)化后的方法在保留時(shí)間以及峰面積方面具有良好的重現(xiàn)性，且可用于進(jìn)行高通量定量分析。

實(shí)驗(yàn)

樣品描述

七種脂溶性維生素：視黃醇乙酸鹽(維生素A乙酸鹽)、視黃醇棕櫚酸鹽(維生素A棕櫚酸鹽)、α-生育酚(維生素E)、α-生育酚乙酸鹽(維生素E乙酸鹽)、麥角骨化醇(維生素D2)、維生素K1、維生素K2(MK-4)；及兩種胡蘿卜素：番茄紅素及β-胡蘿卜素均購(gòu)自西格瑪公司(Sigma Aldrich)，并且未經(jīng)處理直接使用。將所有樣品以約0.1mg/mL的溶解到甲基第三丁基醚(MTBE)中，并轉(zhuǎn)移到進(jìn)樣瓶中，準(zhǔn)備進(jìn)行分析。

UPC2條件

系統(tǒng)： 配備PDA檢測(cè)器的ACQUITY UPC2

流速： 1 mL/min

流動(dòng)相A：CO2

流動(dòng)相B：乙腈

色譜柱： ACQUITY UPLC HSS C18 3.0 x 100 mm，1.8 μm

背壓： 2500 psi

柱度： 30 °C

樣品稀釋劑：MTBE

進(jìn)樣量： 1μL

樣品瓶： 沃特世玻璃瓶12 x 32 mm螺紋頸瓶，2 mL

PDA掃描范圍：210 - 600 nm

數(shù)據(jù)管理： Empower 3軟件

梯度：

結(jié)果與討論

已有大量文獻(xiàn)闡述了利用NPLC及RPLC分離脂溶性維生素以及類胡蘿卜素的方法。1，3-5由于在分析脂溶性維生素時(shí)，通常需要使用低極性有機(jī)溶劑來(lái)溶解樣本，因此NPLC由于其與有機(jī)溶劑的相容性而具有一定優(yōu)勢(shì)，可允許直接進(jìn)樣脂溶性維生素或脂溶性維生素萃取物，而不需要進(jìn)行蒸發(fā)步驟。RPLC法的色譜分離效率雖然高于NPLC，7但由于以下幾點(diǎn)原因，阻礙了其在進(jìn)行FSV分析上的應(yīng)用：1)分析物在流動(dòng)相中溶解度較低，2)對(duì)FSV的保留力強(qiáng)，導(dǎo)致運(yùn)行時(shí)間過(guò)長(zhǎng)。最終，人們選擇使用半水性流動(dòng)相(甲醇或乙腈與水的混合物)或非水性流動(dòng)相；后者也稱為非水性反相(NARP)

LC。7-8 UPC2，雖然常作為正相分離技術(shù)，但也同樣適用于分離極性較低的分析物。UPC2的主流動(dòng)相CO2不僅是低極性分析物的良好溶劑(與己烷的極性相近)，也可與在樣品分離過(guò)程中用于溶解這些分析物的有機(jī)溶劑(例如本研究中所使用的MTBE)相同。此外，CO2的低極性也可促進(jìn)分析物與流動(dòng)相之間的非極性相互作用，從而縮短保留時(shí)間和運(yùn)行時(shí)間。

在進(jìn)行方法開發(fā)時(shí)，共選用了六種色譜柱：ACQUITY UPLC HSS T3、ACQUITY UPLC HSS C18、ACQUITY

UPC2 HSS SB、ACQUITY

UPC2 CSH氟苯基、ACQUITY

UPC2 2-乙基吡啶、及ACQUITY

UPC2 BEH，以及四種溶劑，包括：異丙醇(IPA)、乙腈(ACN)、乙醇、及IPA/ACN的1：1混合液。只有使用ACQUITY UPLC HSSC18色譜柱以及ACN的方法才可將非常相似的維生素K1以及K2分離。采用較低的柱溫，30°C，原因如下：首先，為了提高K1與K2的選擇性；其次，為了最大限度地減少胡蘿卜素在色譜柱上的降解，因?yàn)楹}卜素非常容易氧化。

經(jīng)方法優(yōu)化后所得的每種成分的色譜圖以及UV譜分別如圖2及3所示。大體上，九種脂溶性維生素的洗脫順序與它們的LogP值排序相同。利用低乙腈含量(2%)的流動(dòng)相就可將七種維生素全部洗脫出來(lái)，而兩種胡蘿卜素則需要使用含20%乙腈的流動(dòng)相才可洗脫出來(lái)。這一現(xiàn)象，可由分析物的結(jié)構(gòu)以及它們與流動(dòng)相/固定相之間的相互作用來(lái)解釋。在九種分析物中，均存在CO2與脂溶性維生素親脂性基團(tuán)之間的非極性相互作用，而七種維生素中的氧原子(呈羰基或羧基的形式)使得分析物與流動(dòng)相中的乙腈之間產(chǎn)生極性相互作用，這樣就減少了溶離時(shí)間。而兩種胡蘿卜素分子不含有雜原子，且分子中的非極性十八烷基碳鏈更容易與固定相形成較強(qiáng)的相互作用，因而其溶離時(shí)間更長(zhǎng)。

為了測(cè)試本方法的重現(xiàn)性，將九種脂溶性維生素分別進(jìn)行六次進(jìn)樣，如圖4所示。重現(xiàn)性統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)已概括在表1中。保留時(shí)間的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)差(RSDs)小于0.25%。在峰面積方面，九種脂溶性維生素中，有七種的RSDs小于1%。第一個(gè)峰(維生素A乙酸鹽)的RSD稍大，這是因?yàn)殡S著進(jìn)樣次數(shù)的增加，基線有所上升。不管怎樣，重現(xiàn)性都應(yīng)滿足質(zhì)量監(jiān)測(cè)的要求，其通常要求某一測(cè)試方法的重現(xiàn)性公差為±20%。3

結(jié)論

在本應(yīng)用紀(jì)要中，我們闡述了利用單次進(jìn)樣UPC2法，在四分鐘內(nèi)，將九種脂溶性維生素同時(shí)分離的方法。經(jīng)過(guò)六次重復(fù)進(jìn)樣得知，九種物質(zhì)的保留時(shí)間的RSD均小于0.25%，峰面積的RSD均小于3%(在大多數(shù)情況下<1%)。使用UPC2方法，只需進(jìn)行一次進(jìn)樣就可將混合物中的各種脂溶性維生素分析完畢，而不需要像LC法那樣進(jìn)行多次操作，從而極大地減少了實(shí)驗(yàn)室的工作量。UPC2方法所需時(shí)間是傳統(tǒng)分析方法的四分之一至十分之一。由于UPC2分析法分析速度較快，因此適于食品企業(yè)/營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充劑企業(yè)等分析量通常較大的法規(guī)依從性監(jiān)測(cè)。

參考文獻(xiàn)

1. Santos J， Mendiola JA， Oliveira MBPP， Ibanez E， Herrero M.

Sequential determination of fat- and water-soluble vitamins in green leafy

vegetables during storage. J. Chromatogr. A. 20

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