對于微量而且復(fù)雜的樣品，如蛋白質(zhì)組學(xué)樣品、蛋白藥物中的殘留宿主細胞蛋白（HCP）等，不但需要高靈敏的納升級液相，而且需要更為充分的分離。在線二維納升分離技術(shù)（on-line2D NanoLC）應(yīng)運而生，并已成為微量復(fù)雜樣品液質(zhì)分析所必不可少的分離手段。
傳統(tǒng)的納升在線二維技術(shù)，一般采用強陽離子交換（SCX）作為第一維，反相色譜（RP）作為第二維的分離手段。這種方法是根據(jù)樣品在鹽溶液中的離子特性與疏水性，這兩種屬性間的正交關(guān)系實現(xiàn)的。但是SCX-RP技術(shù)在納升級分離中卻困難重重。困難主要來自SCX分離維度。在SCX分離中需要使用濃度較高的鹽溶液作為流動相，但含鹽流動相易發(fā)生鹽析或?qū)е聵悠吩诠苈穬?nèi)沉淀，而納升液相的管路內(nèi)徑又非常?。?5-100微米）。因此，在實際運用SCX-RP分離時，經(jīng)常出現(xiàn)管路阻塞而導(dǎo)致實驗失敗。
為此，除提供傳統(tǒng)的SCX-RP分離技術(shù)外，沃特世創(chuàng)造性地開發(fā)了雙反相二維分離方法。（RP-RP）。這種RP-RP技術(shù)不必使用高濃度鹽溶液作為流動相，避免了離子交換分離易造成的管路阻塞問題，從而大大提高了納升二維液相的系統(tǒng)穩(wěn)定性和實用性。更令人興奮的是，經(jīng)過哈佛醫(yī)學(xué)院的JarrodA. Marto全面的實驗對比發(fā)現(xiàn)，較SCX-RP方法， 運用RP-RP分離技術(shù)得到的液質(zhì)分析結(jié)果更好（圖1）[1] RP-RP雙反相二維方法可以幫助科學(xué)家得到更多的蛋白質(zhì)分析結(jié)果.
這是因為：
1、SCX方法使用的鹽緩沖液易產(chǎn)生離子噪音背景，從而影響質(zhì)譜數(shù)據(jù)質(zhì)量；
2、SCX分離效果取決于多肽所攜帶的電荷數(shù)，而多肽攜帶電荷數(shù)量類別有限，因此第一維SCX分離度較差，造成液質(zhì)數(shù)據(jù)信息質(zhì)量不高。
R P-RP雙反相分離技術(shù)在第一、第二維都使用了反相色譜，那么它是如何實現(xiàn)二維分離所必須的分離性質(zhì)的正交呢？原來，經(jīng)過研究發(fā)現(xiàn)，在不同pH值環(huán)境下，多肽的反相保留行為是不一樣的（圖2）[2]。根據(jù)這個性質(zhì)，沃特世的科學(xué)家開發(fā)出了獨有的RP-RP納升在線二維系統(tǒng)——nanoACQUITY UPLC® System with 2D-LC。這個系統(tǒng)的分離柱，使用了UPLC一貫的亞二微米顆粒填料，因此具有了UPLC的超高分離度等優(yōu)點。此外，它還不需要分流就可以實現(xiàn)精準的納升流速，可為實驗室節(jié)省巨大的高純度流動相購買費用及廢液處理費用，而且更加環(huán)保。nanoACQUITY UPLC System with 2D-LC雙反相二維系統(tǒng)優(yōu)點總結(jié)如下：
■ 較SCX-RP技術(shù)，使用RP-RP系統(tǒng)可得到更多的蛋白鑒定結(jié)果。
■ RP-RP系統(tǒng)較SCX-RP系統(tǒng)更穩(wěn)定、耐用。
■ 與nano HPLC相比，nanoACQUITY UPLC具有UPLC超群的分離效果。
■ 不分流實現(xiàn)精準的納
nanoACQUITY UPLC System with2D-LC雙反相在線二維系統(tǒng)結(jié)構(gòu)及分析流程如圖3，其中包括三根色譜柱：高pH反相柱、捕獲柱、低pH反相柱。在此系統(tǒng)中，第一維色譜柱為高pH色譜柱。樣品進入第一維色譜柱后，第一維梯度泵可按使用者要求，自動地階梯式提高有機相比例，以將樣品中不同疏水性肽段分批洗脫下來。從高pH反相柱上洗脫下的多肽會被富集柱捕獲。每批次被富集的多肽，將在第二維泵的線性梯度模式下進入低pH反相分析柱，在這里經(jīng)過充分分離后，樣品將到達離子源，進入質(zhì)譜分析器。
其中左下圖為結(jié)構(gòu)示意圖。步驟①：樣品被自動進樣器采集后，在第一維梯度泵的推動下進入高pH色譜柱。步驟②：樣品在第一維泵階梯式梯度作用下，將一部分多肽沖出，后被捕獲柱富集。其中第二維梯度泵通過施加9倍于第一維泵的水相流動相，將溶劑稀釋為適合捕獲柱富集的體系。步驟③：在六通閥切換后，第二維泵通過線性梯度，將多肽樣品進行充分分離并送至質(zhì)譜分析。在執(zhí)行完步驟①后，步驟②與步驟③交替進行直到完成所需分析。雙反相在線二維系統(tǒng)nanoACQUITY UP LC System with2D-LC已經(jīng)在多肽的液質(zhì)分析方面被廣泛應(yīng)用，幫助研究人員取得了眾多極具價值的研究成果。
參考文獻
(1) Zhou F, Cardoza JD, Ficarro SB, Adelmant GO, Lazaro JB, Marto JA.
online Nanoflow RP-RP-MS Reveals Dynamics of Multicomponent Ku Complex in
Response to DNA Damage. J Proteome
Res. 2010, 9, 6242-6255.
(2) Gilar M, Olivova P, Daly AE, Gebler JC. Two-dimensionalseparation of
peptides using RP-RP-HPLC system with different pH in first and second
separation dimensions. J. Sep. Sci. 2005, 28, 1694–1703.
中企檢測認證網(wǎng)提供iso體系認證機構(gòu)查詢，檢驗檢測、認證認可、資質(zhì)資格、計量校準、知識產(chǎn)權(quán)貫標一站式行業(yè)企業(yè)服務(wù)平臺。中企檢測認證網(wǎng)為檢測行業(yè)相關(guān)檢驗、檢測、認證、計量、校準機構(gòu)，儀器設(shè)備、耗材、配件、試劑、標準品供應(yīng)商，法規(guī)咨詢、標準服務(wù)、實驗室軟件提供商提供包括品牌宣傳、產(chǎn)品展示、技術(shù)交流、新品推薦等全方位推廣服務(wù)。這個問題就給大家解答到這里了，如還需要了解更多專業(yè)性問題可以撥打中企檢測認證網(wǎng)在線客服13550333441。為您提供全面檢測、認證、商標、專利、知識產(chǎn)權(quán)、版權(quán)法律法規(guī)知識資訊，包括商標注冊、食品檢測、第三方檢測機構(gòu)、網(wǎng)絡(luò)信息技術(shù)檢測、環(huán)境檢測、管理體系認證、服務(wù)體系認證、產(chǎn)品認證、版權(quán)登記、專利申請、知識產(chǎn)權(quán)、檢測法、認證標準等信息，中企檢測認證網(wǎng)為檢測認證商標專利從業(yè)者提供多種檢測、認證、知識產(chǎn)權(quán)、版權(quán)、商標、專利的轉(zhuǎn)讓代理查詢法律法規(guī)，咨詢輔導(dǎo)等知識。
本文內(nèi)容整合網(wǎng)站：百度百科、搜狗百科、360百科、知乎、市場監(jiān)督總局 、國家認證認可監(jiān)督管理委員會、質(zhì)量認證中心
免責(zé)聲明：本文部分內(nèi)容根據(jù)網(wǎng)絡(luò)信息整理，文章版權(quán)歸原作者所有。向原作者致敬！發(fā)布旨在積善利他，如涉及作品內(nèi)容、版權(quán)和其它問題，請跟我們聯(lián)系刪除并致歉！
