為啥要學(xué)習(xí)使用高效液相色譜柱？

色譜柱的使用和保養(yǎng)：液相色譜儀由高壓液體泵、檢測(cè)器及液相色譜柱等三部分組成，其中液相色譜柱的正確安裝和使用，是液相色譜工作的關(guān)鍵；也是液相色譜工作者獲得正確可靠的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的必經(jīng)之路，建立高效液相色譜柱日常維護(hù)與保養(yǎng)規(guī)程，保證能正常使用。

液相色譜柱的安裝

1、液相色譜柱的結(jié)構(gòu)：

（1）液相色譜柱由柱管、壓帽、卡套（密封環(huán)）、篩板（濾片）、接頭、螺絲（封頭）與柱填料等組成。

柱管：多用不銹鋼制成，若果使用時(shí)柱壓不高于70kg/cm²時(shí)，也可采用厚壁玻璃或石英管，管內(nèi)壁要求有很高的光潔度。用于柱填料的裝填?？罩鹘M件均為不銹鋼材質(zhì)，能耐受一般的溶劑作用。但由于含氯化物的溶劑對(duì)其有一定的腐蝕性，故使用時(shí)要注意，柱及連接管內(nèi)不能長(zhǎng)時(shí)間存留此類溶劑，以避免腐蝕。壓帽：即色譜柱兩端套合于柱管端外壁的塑性圓柱帽，中部有小孔，多為聚四氟乙烯制成，用于固定篩板。

密封環(huán)：位于接頭螺旋環(huán)內(nèi)壁的彈性環(huán)，多為聚四氟乙烯制成，用于色譜柱兩端壓帽與柱外壁的密封。

（2）柱填料：

液相色譜柱的分離作用是在填料與流動(dòng)相之間進(jìn)行的，柱子的分類是依據(jù)填料類型而定。

正相柱：

多以硅膠為柱填料。根據(jù)外型可分為無定型和球型兩種，其顆粒直徑在3-10μm的范圍內(nèi)。另一類正相填料是硅膠表面鍵合-CN，-NH₂等官能團(tuán)即所謂的鍵合相硅膠。

反相柱：

主要是以硅膠為基質(zhì)，在其表面鍵合十八烷基官能團(tuán)(ODS)的非極性填料。也有無定型和球型之分。

常用的其他的反相填料還有鍵合C8、C4、C2、苯基等，其顆粒粒徑在3-10μm之間。

2、色譜柱的安裝：

（1）拆開柱包裝盒，確認(rèn)色譜柱的類型、尺寸、出廠日期以及柱內(nèi)貯存的溶劑。

（2）擰下柱兩端接頭的密封堵頭放回包裝盒供備用。

（3）按柱管上標(biāo)示的流動(dòng)相流向，將色譜柱的入口端通過連接管與進(jìn)樣閥出口相連接(如，條件允許，建議在柱前使用保護(hù)柱)；柱的出口與檢測(cè)器連接。連接管是外徑為1.57 mm、內(nèi)徑為0、1～0.3 mm的不銹鋼管。連接管的兩端均有空心螺釘及密封用壓環(huán)。在接管時(shí)一定要設(shè)法降低柱外死體積。連接管通過空心螺釘、壓環(huán)后盡量用力插到底，然后順時(shí)針擰緊空心螺釘，直到擰不動(dòng)為止。

液相色譜柱的使用

色譜柱在使用前，最好進(jìn)行柱的性能測(cè)試，并將結(jié)果保存起來，作為今后評(píng)價(jià)柱性能變化的參考。但要注意：柱性能可能由于所使用的樣品、流動(dòng)相、柱溫等條件的差異而有所不同；另外，在做柱性能測(cè)試時(shí)是按照色譜柱出廠報(bào)告中的條件進(jìn)行(出廠測(cè)試所使用的條件是最佳條件)，只有這樣，測(cè)得的結(jié)果才有可比性。

1、樣品的前處理：

（1）最好使用流動(dòng)相溶解樣品；

（2）使用予處理柱除去樣品中的強(qiáng)極性或與柱填料產(chǎn)生不可逆吸附的雜質(zhì)；

（3）使用0.45μm的過濾膜過濾除去微粒雜質(zhì)；

2、流動(dòng)相的配制：

液相色譜是樣品組分在柱填料與流動(dòng)相之間質(zhì)量交換而達(dá)到分離的目的，因此，要求流動(dòng)相具備以下的特點(diǎn)：

（1）流動(dòng)相對(duì)樣品具有一定的溶解能力，保證樣品組分不會(huì)沉淀在柱中(或長(zhǎng)時(shí)間保留在柱中)。

（2）流動(dòng)相具有一定惰性，與樣品不產(chǎn)生化學(xué)反應(yīng)(特殊情況除外)。

（3）流動(dòng)相的黏度要盡量小，以便在使用較長(zhǎng)的分析柱時(shí)能得到好的分離效果；同時(shí)，降低柱壓降，延長(zhǎng)液體泵的使用壽命(可運(yùn)用提高溫度的方法降低流動(dòng)相的黏度)。

（4）流動(dòng)相的物化性質(zhì)要與使用的檢測(cè)器相適應(yīng)，如使用UV檢測(cè)器，最好使用對(duì)紫外吸收較低的溶劑配制。

（5）流動(dòng)相沸點(diǎn)不要太低，否則容易產(chǎn)生氣泡，導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)無法進(jìn)行。

（6）在流動(dòng)相配制好后，一定要進(jìn)行脫氣。除去溶解在流動(dòng)相中的微量氣體既有利于檢測(cè)，還可以防止流動(dòng)相中的微量氧與樣品發(fā)生作用。

3、 流速的選擇：

因柱效是柱中流動(dòng)相線性流速的函數(shù)，使用不同的流速可得到不同的柱效。對(duì)于一根特定的色譜柱，要追求最佳柱效，最好使用最佳流速。對(duì)內(nèi)徑為4.6mm的色譜柱，流速一般選擇1mL/min，對(duì)于內(nèi)徑為4.0mm柱，流速0.8mL/min為佳。當(dāng)選用最佳流速時(shí)，分析時(shí)間可能延長(zhǎng)。可采用改變流動(dòng)相的洗滌強(qiáng)度的方法以縮短分析時(shí)間(如，使用反相柱時(shí)，可適當(dāng)增加甲醇或乙腈的含量)。

4、 流動(dòng)相使用注意事項(xiàng)：

（1）由于甲醇廉價(jià)，對(duì)于反相柱推薦使用甲醇體系(必須使用乙腈的場(chǎng)合除外)。

（2）對(duì)于正相柱推薦使用沸程為30-60℃的石油醚或提純后的己烷作流動(dòng)相，沒有提純的己烷不得使用。用水最好使用超純水(電阻率大于18兆歐)，去離子水及雙蒸水中含有酚類雜質(zhì)，有可能影響分析結(jié)果。

（3）含水流動(dòng)相最好在實(shí)驗(yàn)前配制，尤其是夏天使用緩沖溶液作為流動(dòng)相不要過夜。最好加入疊氮化鈉，防止細(xì)菌生長(zhǎng)。

（4）流動(dòng)相要求使用0.45μm濾膜過濾，除去微粒雜質(zhì)。

（5）使用HPLC級(jí)溶劑配制流動(dòng)相，使用合適的流動(dòng)相可延長(zhǎng)色譜柱的使用壽命，提高柱性能。

液相色譜柱的保存

1、反向色譜柱實(shí)驗(yàn)后的保養(yǎng)：

使用緩沖液或含鹽的流動(dòng)相，實(shí)驗(yàn)完后應(yīng)用10%的甲醇/水沖洗30分鐘，洗掉色譜柱中的鹽，再用甲醇沖洗30分鐘。注意：不能用純水沖洗柱子，應(yīng)該在水中加入10%的甲醇，防止將填料沖塌陷。

2、長(zhǎng)期保存色譜柱：

如，色譜柱要長(zhǎng)時(shí)間保存，必須存于合適的溶劑下，對(duì)于反相柱可以儲(chǔ)存于純甲醇或乙腈中，正相柱可以儲(chǔ)存于嚴(yán)格脫水后的純正己烷中，離子交換柱可以儲(chǔ)存于水(含防腐劑疊氮化鈉或硫柳汞)中，并將堵頭堵上，儲(chǔ)存溫度最好是室溫。

液相色譜柱的再生

因?yàn)椋V柱是消耗品，隨著使用時(shí)間或進(jìn)樣次數(shù)的增加，會(huì)出現(xiàn)色譜峰高降低，峰寬加大或出現(xiàn)肩峰的現(xiàn)象，一般來說是柱效的下降。

1、反向柱的再生：

依次采用20～30倍的色譜柱體積的甲醇:水=10:90(V/V)，乙腈，異丙醇作為流動(dòng)相沖洗色譜柱，完成后再以相反順序沖洗色譜柱。

2、正相柱的再生：

依次以20～30倍的色譜柱體積正己烷、異丙醇(異丙醇粘度大，可降低流速，避免壓力過高)、二氯甲烷、甲醇作為流動(dòng)相沖洗色譜柱，然后再以相反的順序沖洗色譜柱。要注意以上溶劑必須嚴(yán)格脫水。

3、離子交換柱的再生：

長(zhǎng)時(shí)間在緩沖溶液中使用和進(jìn)樣，將導(dǎo)致色譜柱離子交換能力下降。用稀酸緩沖溶液沖洗可以使陽離子柱再生，反之，用稀堿緩沖溶液沖洗可以使陰離子柱再生。

特別說明：

再生過程必須隨時(shí)關(guān)注柱壓變化，柱壓過高易導(dǎo)致硅膠變形與開裂及鍵合相極性端連接順序紊亂，同時(shí)要保證再生時(shí)間足夠。再生時(shí)最好選擇不具備在線脫氣的獨(dú)立泵送系統(tǒng)色譜儀器進(jìn)行，以防正相溶劑損壞脫氣機(jī)密封膜或分子篩及比例閥等儀器精密部件。

液相色譜柱常見問題分析與解決方案

1、使用一段時(shí)間后柱壓過高：

解決方案：首先查看是否HPLC系統(tǒng)原因，排除系統(tǒng)原因后，原因基本是由于實(shí)驗(yàn)過程中雜質(zhì)在柱中的累積。盡量完善操作條件，做完樣品后要及時(shí)沖洗干凈，如緩沖鹽的流動(dòng)相一定要用高比例的水溶液(如，90%)沖洗完全后再用有機(jī)相保存。

2、篩板堵塞與柱頭塌陷：

解決方法：如確定是色譜柱頭的過濾篩板被污染，可以將色譜柱反方向用甲醇沖洗至正常壓力，或者卸下色譜柱頭，小心取下篩板，用5%左右的硝酸溶液超聲處理20分鐘左右，再用純水超聲20分鐘左右，重新裝入色譜柱。

3、色譜柱頭的填料被樣品污染：

解決方法：

如確定色譜柱頭的填料被污染，將柱頭螺絲卸下，挖出柱內(nèi)前段被污染的填料，用相同的柱填料重新填入，仔細(xì)修復(fù)后，重新安裝上柱頭螺絲。

4、色譜柱內(nèi)緩沖液中的鹽遇到高濃度的甲醇或其他有機(jī)溶劑，形成結(jié)晶析出：

解決方法：

如確定是鹽結(jié)晶，用10%的甲醇/水沖洗色譜柱使柱內(nèi)鹽全部溶解，再換高濃度甲醇。

注意事項(xiàng)：

1、無論何時(shí)，必須保證色譜柱柱床不干涸，尤其是進(jìn)樣檢測(cè)和柱沖洗過程中不能讓流動(dòng)相長(zhǎng)時(shí)間(30min以上)走空，否則易使色譜柱干涸且?guī)氪罅繋缀鯚o法排出的氣泡，甚至導(dǎo)致柱床局部塌陷或中部開裂。

2、使用與保存時(shí)，嚴(yán)禁用力甩，絕對(duì)杜絕不小心猛烈撞擊或高處掉落，否則，易導(dǎo)致柱床機(jī)械性損壞，則再無再生可能。

3、當(dāng)柱子和色譜儀聯(lián)結(jié)時(shí)，閥件或管路一定要清洗干凈；

4、避免使用高粘度的溶劑作為流動(dòng)相；

5、進(jìn)樣樣品要全溶解；

6、大多數(shù)反相色譜柱的pH穩(wěn)定范圍是2～7.5，盡量不超過該色譜柱的pH范圍；

7、每天分析工作結(jié)束后，要清洗進(jìn)樣閥中殘留的樣品；

8、每天分析測(cè)定結(jié)束后，都要用適當(dāng)?shù)娜軇﹣砬逑粗?/p>

9、若分析柱長(zhǎng)期不使用，應(yīng)用適當(dāng)有機(jī)溶劑保存并封閉。