分光光度計是利用物質(zhì)對光的選擇性吸收進行物質(zhì)的定性或定量分析的儀器，在各行各業(yè)得到了廣泛應用，主要用于物質(zhì)純度檢查、定量分析、物質(zhì)結(jié)構(gòu)鑒別等?？蓽y量結(jié)果總會出現(xiàn)可接受或不可接受的誤差，誤差來源于測量過程的各個方面，我認為主要來源于儀器本身性能和測量條件的選擇兩個方面。
儀器本身性能帶來的誤差
1.復色光對比耳定律的偏離
比耳定律成立的前提條件是人射光是單色光，但是精度再高的儀器，即使是雙單色器的分光光度計，也只能獲得近乎單色的光，無法獲得純單色光，它仍然含有狹窄光通帶，具有復色光的性質(zhì)。而復色光會導致比耳定律的正或負偏離。
固定狹縫的紫外分光光度計光譜帶寬一般為1nm或2nm，可調(diào)狹縫的可以做到0.Inm;可見分光光度計帶寬6nm、snm，甚至十幾納米。光譜帶寬應該是越小越好，但是隨著光譜分辨率的提高，儀器的靈敏度降低，所以選擇儀器時要綜合考慮各種條件的影響。當溶液濃度較小且單色光較純時，可近似認為符合比耳定律。
2.雜散光的影響
雜散光是指進人檢測器的處于待測波長光譜帶寬范圍外的其他波長組分，它是光譜測量中誤差的主要來源。產(chǎn)生原因有:分光光度計的色散元件、反射鏡、透鏡及單色器內(nèi)壁灰塵等。在分光光度計工作波段邊緣波長處，由于單色器透光率、光源輻射強度、檢測器靈敏度都較低，雜散光的影響更為顯著。雜散光限制儀器的分析上限可引起嚴重的測量誤差，實際工作中，在定量分析時，一般在吸收峰或其附近處測量樣品吸光度，如果在分析波長處含有雜散光，這時樣品的透光率較小，而雜散光大部分透過，使測量吸光度低于真實吸光度。
3.儀器噪聲對測t的影響
儀器噪聲也是儀器的一個重要指標，它表征儀器做稀溶液的能力。是疊加在待測量的分析信號中的不需要的信號，掃描100%T和0%T線，可觀察到分光光度計的絕對噪聲水平，如果儀器噪聲較大，會掩蓋較小的測量信號，一般用噪音的二倍來表示儀器的靈敏度。
4.波長和吸光度準確度
樣品的每一個值都是在一定的波長下測得的，如果波長誤差很大，測出的值肯定不準。吸光度準確度也是用戶對儀器的直接要求，更應引起足夠的重視。國家計量檢定規(guī)程規(guī)定雙光束紫外可見分光光度計透射比準確度為A級士0.6%,B級土1.0%。
測量條件的選擇
1.參比溶液和溶劑的選擇
分光光度計的測量實際上是以通過參比池的光強度作為人射光強度來測定試樣的吸光度，先調(diào)節(jié)儀器使透過參比池溶液的吸光度為零，然后讓同一束光通過樣品，使得吸光度比較真實地反映待測物質(zhì)的濃度，所以參比溶液的選擇非常重要。如果僅有待測物質(zhì)與顯色劑的反應產(chǎn)物有吸收，可用純?nèi)軇┗蛘麴s水作參比溶液。如果顯色劑有顏色，并在測定波長下有吸收，則用顯色劑溶液作參比溶液，所加人顯色劑及其它試劑的量，與試樣中的加入量應一致。如果樣品中其它組分本身的顏色對測定有干擾，而所用顯色劑沒顏色，則用不加顯色劑的樣品溶液作參比液。正確選擇合適的溶劑，對提高分析的準確度起重要作用。為減小溶劑中雜質(zhì)的影響，應選擇高純度的溶劑;溶劑應不與待測物質(zhì)發(fā)生化學反應;待測物在溶劑中要有一定的溶解度;在測定的波長范圍內(nèi)，溶劑本身沒有吸收，注意常用溶劑的zui短可用波長;當用揮發(fā)性大的溶劑時，測量過程中吸收池應加蓋。
2.測試波長的選擇
當用分光光度計對溶液進行測定時，首先需要選擇合適的測量波長。選擇的依據(jù)是該被測溶液的吸收曲線。在一般情況下，我們總是選擇最大吸收波長作為測量波長，這樣可以提高靈敏度。而在有些情況下最大吸收峰很尖銳、吸收過大或附近有干擾存在，就不能選最大吸收波長，而必須在保證有一定靈敏度的情況下，選擇吸收曲線中的其它波長進行測定（曲線較平坦處對應的波長），以消除干擾。繪制吸收曲線是正確選擇波長的有效手段和方法。
3.吸光度范圍的選擇
試樣在不同吸光度時，濃度的相對誤差不同，一般選擇A在0.2-0.8之間，濃度相對誤差較小，可以通過改變吸收池厚度、檢測波長或待測溶液濃度，使吸光度讀數(shù)在適宜范圍內(nèi)。
4.狹縫寬度的選擇
狹縫寬度不僅影響光譜的純度，也影響吸光度值，在定量分析時，為了得到足夠的測量信號，應采用較大狹縫。在定性分析時，為了提高分辨率，應采用較小狹縫，以獲得精細的光譜結(jié)構(gòu)。
5.吸收池的選擇和使用
吸收池的規(guī)格應根據(jù)被測溶液顏色深淺來確定，一般是被測溶液顏色深時選光程短的，顏色淺時選光程長的，同一實驗使用同一規(guī)格同一套吸收池。在定量測量之前需要對吸收池作校正和配對工作，吸收池不匹配時，對測量產(chǎn)生誤差，吸收池方向不同，透光率亦有差異，使用時應注意方向。比色皿毛玻璃一面的上端有一個箭頭，應與光路保持一致。另外，使用時，不要把溶液注得太滿，以防在推動比色皿架時溶液溢出皿外。如透光壁外有溶液存在，要擦干再測，否則將產(chǎn)生誤差。
6.溫度的選定
溫度對溶液顏色的深淺和吸光度都有影響，溫度升高，紫外一可見光譜吸收向短波方向移動。故在繪制標準曲線和測定樣品時，應保持溫度一致，通常在室溫條件下進行。由于分光光度計引起的測量總誤差除來自儀器自身性能、測量條件外，還來自于分析過程的各個步驟，如試樣處理、分離富集等，可能由于化學操作引起待測組分的損失和雜質(zhì)的引人。所以出現(xiàn)不可接受的測量誤差時要從多方面分析。儀器的正確使用和保養(yǎng)也很重要，我們應該做到以下幾點:堅持標準溶液現(xiàn)用現(xiàn)配，不使用過期溶液;比色皿應保持清潔、干燥，禁止用硬物碰擦透明表面;防止儀器振動，影響測量穩(wěn)定性;在開機狀態(tài)，不測量時，應打開樣品池門，延長光電傳感器壽命;樣品集中測量，避免開機次數(shù)，延長光源壽命;一旦停機，則應待燈冷卻后再重新啟動，并預熱15min左右再使用;要經(jīng)常更換儀器的干燥劑，防止光學元件和光電傳感器受潮生霉;儀器搬動或更換重要部件后，要重新進行性能確認，以保證測量結(jié)果的準確。
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